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Predire l´autismo usando la genetica

Un nuovo studio ha identificato un sistema basato su un elevato numero di geni per predire con una buona accuratezza lo Spettro Autistico.


Autori dello studio: E Skafidas, R Testa, D Zantomio, G Chana, I P Everall e C Pantelis

Articolo scientifico originale: Predicting the diagnosis of autism spectrum disorder using gene pathway analysis


Riportato e annotato da David Vagni


Un nuovo test diagnostico basato su 273 polimorfismi genetici è in grado di predire circa il 71% dei casi di Spettro Autistico, individuando i percorsi biologici più frequenti.




Le condizioni dello spettro autistico (ASD) sono diagnosticate a seguito di un colloquio clinico senza biomarcatori ad aiutare la diagnosi. Lo studio di Skafidas e collaboratori ha riguardato polimorfismi a singolo nucleotide (SNP) in individui con ASD presi dal database genetico Autism Resource Exchange (AGRE). Gli SNPs sono stati mappati con l´Enciclopedia dei geni e genomi di Kyoto (KEGG) in modo da identificare i percorsi e processi cellulari coinvolti e sviluppare un test diagnostico.


Questo test è stato poi applicato a due campioni indipendenti dalla Simons Autism Research Foundation Initiative (SFARI) e del Wellcome Trust 1958 (WTBC) al fine di convalidarli con campioni tipici. Utilizzando i dati AGRE relativi ad una coorte del centro-europa (CEU), è stato creato un classificatore genetico e diagnostico che consiste di 237 SNPs presenti in 146 geni che hanno correttamente predetti una diagnosi di ASD nel 85,6% dei casi CEU.


Questo classificatore ha anche predetto l´84,3% dei casi in una coorte toscana (Italia), tuttavia, la previsione era meno precisa (56,4%) in una coorte geneticamente dissimili: cinese Han (HAN).


Otto SNPs in tre geni (KCNMB4, GNAO1, GRM5) hanno avuto il più grande effetto nel classificatore con una certa quantità di SNPs di vulnerabilità, mentre altri erano di protezione rispetto allo Spettro Autistico.


La classificazione diagnostica ha correttamente previsto diagnosi di ASD con una precisione del 71,7% in individui CEU dal SFARI (ASD) e WTBC (controlli) quando è stata eseguita la convalida. In conclusione, il test sviluppato è sufficentemente accurato per un gruppo geneticamente omogeneo di bambini ASD è può aiutare nella diagnosi precoce.


Mentre gli SNPs differiscono tra i gruppi etnici, l´approccio percorso da Skafidas e collaboratori ha individuato processi cellulari comuni tra diverse etnie.


Il campione di riferimento era composta da 2609 soggetti con ASD (tra cui l´autismo, Asperger o Disturbo Generalizzato dello Sviluppo non altrimenti specificati, ma esclusi sindrome di Rett e X fragile), e 4.165 genitori disponibile da AGRE. I campioni indipendenti di convalida: sono stati 737 bambini con DSA (ADI-R diagnosticata) derivati da SFARI e 2.930 soggetti di controllo da WTBC.


Poiché i tassi di incidenza SNP variano in base al patrimonio genetico dell´etnia di riferimento, i dati di HapMap sono stati utilizzati per assegnare ciascuno alla proprio etnia. Gli individui di etnia mista sono stati esclusi. HapMap ha i dati relativi a circa un milione e mezzo di SNP presenti in 11 etnie. Ogni SNP non incluso nei dati AGRE misurati è stato scartato per un totale di circa mezzo milione di SNP studiati. E´ stato escluso il DNA mitocondriale. I 30 SNP prevalenti (> 95%) all´interno di ogni etnia sono stati identificati e ogni individuo ASD assegnato al gruppo per il quale ha condiviso il maggior numero di SNPs etnico-specifici.


Per ogni individuo è stata costruita una base di 775 SNP in modo da usarli per la predizione della diagnosi ed identificare i più significativi Ciò ha portato a selezionare 237 SNP per l´analisi statistica. A ciascun SNP è stato associato un valore di 0, 1 o 3 a seconda che fosse presente l´allele dominante (quello comune), o quello minore (quello mutante) rispettivamente omozigote (una copia) od eterozigote (tutte e due le copie), secondo un modello chiamato "superadditivo", in quanto pesa la presenza di due copie in modo maggiore rispetto alla presenza di una copia (assegnando valore 3 al posto che 2). Il campione europeo è stato suddiviso in un training set (732 individui con ASD e 123 controlli) e il resto è stato utilizzato per la validazione.


I percorsi più significativi sono stati: segnalazione della via del calcio, giunzione sinaplita, depressione a lungo termine (LTD), potenziale a lungo termine (LTP), trasduzione olfattiva e proteine di segnalazione che attivavano la chinasi mitogena. Nel gruppo cinese Han individuato sono stati individuati sei percorsi che si sovrapponevano con i 13 percorsi nella coorte CEU, tra cui: il metabolismo delle purine, segnalazione di calcio, segnalazione fosfatidilinositolo, giunzione sinaptica, potenziamento a lungo termine e depressione a lungo termine. Relativamente a queste vie, gli SNP statisticamente significativi in entrambe le popolazioni sono rs3790095 in GNAO1, rs1869901 all´interno PLCB2, rs6806529 e rs9313203 all´interno di ADCY5 in ADCY2.


Dai 775 SNP identificati nella coorte CEU, una precisa classificazione genetica di ASD rispetto a non-ASD è stata possibile utilizzando 237 SNP altamente significativi (P <0,005). La figura mostra la distribuzione degli individui ASD basata sulla classificazione genetica. Lo stato clinico di un individuo è stato impostato su ASD se il punteggio supera la soglia di 3.93. Questa soglia corrisponde ai punti di intersezione delle due curve normali. L´errore di classificazione teorica era 8,55%, e i valori predittivi positivi (ASD) e negativi (controlli) erano 96,72% e 94,74%, rispettivamente. La precisione di classificazione per i 285 individui CEU di convalida AGRE era 85,6% e 84,3% per la STI, mentre la precisione per la popolazione cinese Han era solo del 56,4%. Utilizzando lo stesso classificatore con l´identico insieme di SNP, l´accuratezza della predizione della ASD negli insiemi di dati indipendenti era 71,6%; la precisione predittiva positiva e negativa erano 70,8% e 71,8%, rispettivamente.


Nota: il fatto che il test individui circa il 70% dei soggetti autistici in questo campione non implica che sia un test usabile per scopi "eugenetici". Infatti se consideriamo 1.000 bambini ed un numero di bambini autistici pari all´1% (cioé 10). Questo significa che sui 1.000 bambini il test individuerà correttamente 7 bambini autistici su 10, ma che verranno considerati "geneticamente autistici" ben 290 bambini sani sul 990. Quindi si è ben lontani dall´utilizzo come screening prenatale, ma può essere un utile contributo per convalidare una diagnosi clinica e capire quali differenze genetiche specifiche ci sono in un singolo bambini ed eventualmente come intervenire.


Gli SNP sono stati confrontati tra individui ASD e tipici. I parenti (genitori e fratelli non autistici) rientrano tra le due distribuzioni, con un punteggio medio di 2.68 (SD = 2.27). La sovrapposizione percentuale dei parenti e degli individui ASD è stata del 30,4%.


I punteggi medi delle madri e dei padri non hanno mostrato differenze (a P = 0,05) con punteggi di 2.83 (DS = 2.17) e 2,93 (DS = 2.34), rispettivamente, mentre fratelli non autistici (che non soddisfano i criteri diagnostici per ASD) sono risultati intermedi tra i genitori ed i fratelli clinici (media = 4,74, sd = 3.80).


Delle 237 SNP all´interno del classificatore, alcuni hanno contribuito alla vulnerabilità all´ASD, mentre altri erano di protezione. Otto SNPs in tre geni, GRM5, GNAO1 e KCNMB4, erano altamente discriminatori per determinare la classificazione di un individuo come ASD o non-ASD. Per KCNMB4, rs968122 ha fortemente contribuito a una diagnosi clinica di ASD, mentre rs12317962 era protettivo, per GNAO1, SNP rs876619 ha contribuito, mentre rs8053370 era protettivo, per GRM5, SNP rs11020772 ha contribuito, mentre rs905646 e rs6483362 sono stati di protezione.


Utilizzando l´analisi del percorso biologico, è stato generato un classificatore genetico basato su una funzione lineare di 237 SNP che ha accuratamente distinti gli ASD dai controlli all´interno di una coorte europea. Anche se solo 627 SNP erano evidentemente differenti tra STI e coorti CEU, questa cifra è salita a oltre centomila tra europei e cinesi Han.


E´ probabile che un ulteriore set di SNPs possa essere predittivo di diagnosi di ASD nei cinese Han, sfruttando gli stessi metodi di questo esperimento.


È interessante notare, che i genitori e i fratelli di ASD sono risultati intermedi tra l´ASD ed i controlli, rafforzando l´idea di una base genetica-ereditaria per l´ASD. Se si riducono di molto il numero di SNP usati nel classificatore, si riduce l´accuratezza diagnositica (50% con 10 SNP), l´accuratezza predittiva si riduce ma i genitori risultano indistinguibili statisticamente dai controlli. Questo suggerisce che l´uso dei come controlli è valida solo se si esaminano un piccolo numero di SNP dal grande effetto ma non è appropriato se si vuole valutare l´interazione genetica a largo raggio.


I polimorfismi che hanno contribuito maggiormentealla diagnosi nel classificatore corrispondevano ai geni per KCNMB4, GNAO1, GRM5, INPP5D e ADCY8. I tre SNPs che marcatamente sbilanciano verso un individuo ASD riguardavano i geni che codificano per KCNMB4, GNAO1 e GRM5. Per contro, sono stati trovati, un numero di SNP protetti contro l´ASD, compresi rs8053370 (GNAO1), rs12317962 (KCNMB4), rs6483362 e rs905646 (GRM5). KCNMB4 è un gene che controlla il canale potassio, importante nell´eccitabilità neuronale ed implicata nell´epilessia e nella dyskinesia. E´ altamente espresso nel giro fusiforme, così come nel temporale superiore e nelle regioni cingolo e orbitofrontale, che sono le aree coinvolte nell´identificazione del viso e delle emozione. GNAO1 è una proteina G che si accoppia con molti neurotrasmettitore recettori. Nelle cavie il suo malfunzionamento porta ad una ridotta interazione sociale, scarse capacità motorie, ansia e stereotipie. GNAO1 ha un ruolo nello sviluppo nervoso e insieme a GRIN1 nella topografia di dendriti e sinapsi, e insieme a GAP-43 con la crescita neuronale. Aumentati livelli di GAP-43 sono stati individuati nella materia bianca adiacente alla corteccia cingolata anteriore nei cervelli di pazienti ASD.


Nei risultati, polimorfismi diversi di GRM5 hanno avuto sia effetti di aumento di rischio che protettivi. GRM5 è altamente espresso nell´ippocampo, nel giro temporale inferiore, nel giro frontale inferiore e putamen.GRM5 ha un ruolo nella plasticità sinaptica, modulazione dell´eccitazione sinaptica, la funzione immunitaria innata e l´attivazione microgliale. Modulatori allosterici GRM5-positivi possono invertire gli effetti negativi del comportamento di antagonisti del recettore NMDA, incluse stereotipie, deficit sensoriali e motori, memoria. Per quanto riguarda il coinvolgimento GRM5 nella funzione autoimmunitaria del cervello, questo recettore è espresso sulla microglia, la cui attivazione anomala è stata dimostrata nella corteccia prefrontale delle persone ASD.


In conclusione, entro popolazioni geneticamente omogenee, il classificatore genetico di Skafidas e collapboratori ha ottenuto un elevato livello di accuratezza diagnostica. Ciò dimostra che i biomarcatori genetici possono classificare correttamente individui ASD da non-ASD. Inoltre, l´approccio di identificare gruppi di SNP che popolano noti percorsi biologici ha individuato potenziali processi cellulari che sono anomali nell´ASD, e comuni tra i gruppi etnici. Infine, è stato identificato un piccolo numero di geni con SNP di vario peso che determinata fortemente se un soggetto rientra nel gruppo di controllo o ASD. Nel complesso questi risultati indicano che un test basato SNP può consentire l´identificazione precoce dell´ASD. Un classificatore predittivo come descritto qui può fornire uno strumento per lo screening alla nascita o durante l´infanzia per fornire un indice di "rischio". Identificare le traiettorie dello sviluppo clinico all´interno di tale gruppo potrebbe offrire la possibilità di studiare i potenziali interventi psicologici, sociali, farmacologici e/o dietetici per prevenire o migliorare la prognosi.
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